اطلاعات اولیه
این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی ، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده ، استفاده کرد.PCR بطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم ، بوجود آمد. امروزه دستگاههایی بطور تجارتی تهیه میشوند که در آنها جایگاههای لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است. π چرخه PCR ، DNAی مورد نظر را 2π بار تکثیر می‌کند.
تاریخچه
در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده میشود.واکنش زنجیره ای پلیمراز روشی است که قسمتی از سکانس مولکول DNA که بین دو پرایمر قرار دارد توسط آنزیم پلیمراز وبکمک چهار داکسی نوکلئوتید تری فسفات در آزمایشگاه تکثیر (Amplify) میشود. .dsDNA متشکل از دو رشته آنتی پارالل میباشد که توسط اتصالات هیدروژنی وبصورت کووالانت به یکدیگر متصل هستند.
همانند سازی DNA بکمک الیگو نوکلئو تید هایی که پرایمر گفته میشوند انجام میگیرد. الیگونوکلئوتیدها مولکولهای DNA تک رشته کوتاه هستند که هر کدام از آنها مکمل یک انتهای سکانس DNA هد ف ( الگو ) می باشند.
پرایمر ها توسط آنزیم DNA پلیمراز و در حضور dNTPها از روی DNA الگو ( تک رشته ای است ) همانند سازی میکنند و رشته های جدیدی مکمل رشته های هدف سنتز میگردد.
مراحل یک سیکل PCR :
1- مرحله Denaturation : در این مرحله DNA هدف بر اثر حرارت تک رشته ای میشود.
2- مرحله Annealing : در این مرحله با کاهش حرارت سیستم ، پرایمر ها در محل مناسب روی رشته مکمل متصل میشوند
3- مرحله Extension : در این مرحله که دمای آن برای آنزیم DNA پلیمرازمطلوب میباشد موجب توسعه پرایمر ها شده و همانند سازی DNA هدف انجام میگیرد. محصول PCR عبارت است از قطعه همانند سازی شده ای که دو طرف این قطعه سکانس پرایمر ها وجود دارند .
فاکتور هایی که روی کار آیی PCR تاثیر دارند:
1- بعد از 25تا 30 سیکل بعلت حرارت آنزیم دناتوره شده و غیر فعال میشود
2- غلظت زیادرشته های هدف موجب Reannealingآنها شده و با پرایمر ها رقابت میکنند .
روش PCR توسط مولیس کارمند شرکت Cetus ابداع گردید. ابتدا این کار توسط سه بن ماری با حرارت های مختلف انجام میگرفت واز آنریم کلنو بعنوان DNA polymerase استفاده میشد. این آنزیم در اثرحرارت دناتوره میشودو اجبارا"باید دوباره در هر سیکل به واکنش اضافه شود. Saiki از آنزیم DNA polymerase مقاوم به حرارت که از باکتری ترموس آکواتیکوس خالص میشود و اصطلاحا" Taq DNA polymerase گفته میشود استفاده کرد وامروزه واکنشPCR بصورت اتوماتیک انجام میگیرد.
پارامتر های موثر در PCR :
1- زمان و دمای Denaturation بستگی به تعداد G و C دارد
2- دمای Annealing پرایمرها که باید 3-4 درجه کمتر از دمای ذوب پرایمر ها باشد
3- زمانPrimer extension که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد
4- - تعداد سیکلها
5- Ramp ( زمانی که طول میکشد تا دمای مبدا دستگاه به دمای مقصد برسد ) هرچه این زمان کمتر باشد نتیچه کار بهتر است و واکنش زمان کمتری در دمای ناخواسته قرار میگیرد
6- غلظت dNTP ها و یون منیزیوم ( اینها مجموعه ای را تشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز میشوند و غلظت این دو ماده تابعی از یکدیگر میباشند )
7- غلظت Template DNA ( یک دهم تا یک میکروگرم میباشد ) چنانچه DNA هدف بصورت مالتی کپی در ژنوم باشد بهتر است.
8- اضافه کردن تشدید کننده های PCR
10- حذف مها رکننده های آنزیم از محیط
11- بهتر نقطه ذوب پرایمر ها (شبیه هم باشد ( Tm یکسان داشته باشند).
کاربردهای مهم PCR
تهیه نسخه‌های متعدد از یک ژن مورد نظر: گاهی برای مطالعات بیولوژی مولکولی لازم است که یک ژن با نسخه‌های نسبتا زیاد در دسترس باشد. بدین منظور می‌توان با استفاده از روش PCR ژن مورد نظر را در مقایسه با بقیه ژن‌ها تکثیر نمود.
بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن: با استفاده از این روش می‌توان تشخیص داد که آیا یک ژن در یک سلول حضور دارد یا نه؟ گاهی نیز از این مطالعات برای بررسی وجود ژنهای مختلف باکتری‌ها یا ویروس‌ها در بدن افراد استفاده میکنند.
تشخیص بیماریهای قبل از تولد: با استفاده از PCR و بکار گرفتن پرایمرهای مربوط به یک ژن بیمار و پرایمرهای مربوط به ژن سالم آلل آن می‌توان از تولد کودکان دارای بیماریهای ژنتیکی جلوگیری کرد. برای این کار بعد از لقاح تخمک در آزمایشگاه ، بعد از رسیدن تخمک به حالت 10 سلولی ، یک سلول را جدا کرده و با استفاده از پرایمرها از ژن مورد نظر PCR صورت میگیرد، اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تکثیر پیدا کرد، این مفهوم هموزیگوت بودن سلول‌های جنینی و سالم بودن آنهاست.
تعیین جنسیت جنین: معمولا چند تخمک با چند اسپرم در آزمایشگاه لقاح می‌یابند و سپس اجازه تکثیر به سلول تخم داده و با رسیدن تخم به مرحله ده سلولی ، یکی از سلول‌ها را جدا کرده و بوسیله پرایمرهای ویژه مربوط به کروموزوم y مورد PCR قرار میگیرد. کروموزوم y منحصرا در سلول‌های نر دیده میشود. اگر قطعه تولید نشده در PCR بوسیله الکتروفورز و بطور دقیق‌تر توسط ساترن بلوتینگ تشخیص داده شد، جنین از نوع پسر و در غیر این صورت دارای کروموزوم‌های xx خواهد بود
تشخیص بیماریها
کشت میکروبها که جهت تشخیص بیماریهای عفونی در اکثر آزمایشگاهها بکار می‌رود. زمان‌بر بوده و ثانیا باعث افزایش تعداد میکروب‌های بیماریزا و غیر بیماریزا در شرایط آزمایشگاهی میگردد. امروزه در برخی آزمایشگاهها روش PCR جایگزین روش‌های کشت شده است. یعنی قطعه‌ای از ژن مربوط به میکروب بیماریزا مورد شناسایی قرار گرفته و پرایمرهای مربوط تولید میشوند، با استفاده از این پرایمرها می‌توان تشخیص داد که آیا ویروس ایدز در داخل بدن وجود دارد یا نه؟
مشکل PCR و راه حل آن
اشکال PCR ، آلودگی نمونه‌های مورد بررسی توسط قطعات DNA خارجی است. اگر قبلا در داخل دستگاهی PCR یک نمونه انجام گرفته باشد. و ذره کوچکی از آن در داخل دستگاه باقی بماند. در PCR نمونه بعدی مشکل ایجاد خواهد کرد. برای رفع مشکل امروزه از ظروف یکبار مصرف استفاده میشود. کلیه ظروف قبل از استفاده اتوکلاو میشوند تا سلول‌ها و مولکولهای موجود در آنها ، حتی‌الامکان غیر فعال میشوند.
هیچ نظری موجود نیست:
ارسال یک نظر