PCR

Polymerase Chain Reaction) PCR)

اطلاعات اولیه
این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی ، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده ، استفاده کرد.PCR بطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم ، بوجود آمد. امروزه دستگاههایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آنها جایگاههای لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است. π چرخه PCR ، DNAی مورد نظر را 2π بار تکثیر می‌کند.
تاریخچه
در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود.واکنش زنجیره ای پلیمراز روشی است که قسمتی از سکانس مولکول DNA که بین دو پرایمر قرار دارد توسط آنزیم پلیمراز وبکمک چهار داکسی نوکلئوتید تری فسفات در آزمایشگاه تکثیر (Amplify) میشود. .dsDNA متشکل از دو رشته آنتی پارالل میباشد که توسط اتصالات هیدروژنی وبصورت کووالانت به یکدیگر متصل هستند.
همانند سازی DNA بکمک الیگو نوکلئو تید هایی که پرایمر گفته میشوند انجام میگیرد. الیگونوکلئوتیدها مولکولهای DNA تک رشته کوتاه هستند که هر کدام از آنها مکمل یک انتهای سکانس DNA هد ف ( الگو ) می باشند.
پرایمر ها توسط آنزیم DNA پلیمراز و در حضور dNTPها از روی DNA الگو ( تک رشته ای است ) همانند سازی میکنند و رشته های جدیدی مکمل رشته های هدف سنتز میگردد.
مراحل یک سیکل PCR :
1- مرحله Denaturation : در این مرحله DNA هدف بر اثر حرارت تک رشته ای میشود.
2- مرحله Annealing : در این مرحله با کاهش حرارت سیستم ، پرایمر ها در محل مناسب روی رشته مکمل متصل میشوند
3- مرحله Extension : در این مرحله که دمای آن برای آنزیم DNA پلیمرازمطلوب میباشد موجب توسعه پرایمر ها شده و همانند سازی DNA هدف انجام میگیرد. محصول PCR عبارت است از قطعه همانند سازی شده ای که دو طرف این قطعه سکانس پرایمر ها وجود دارند .
فاکتور هایی که روی کار آیی PCR تاثیر دارند:
1- بعد از 25تا 30 سیکل بعلت حرارت آنزیم دناتوره شده و غیر فعال میشود
2- غلظت زیادرشته های هدف موجب Reannealingآنها شده و با پرایمر ها رقابت میکنند .
روش PCR توسط مولیس کارمند شرکت Cetus ابداع گردید. ابتدا این کار توسط سه بن ماری با حرارت های مختلف انجام میگرفت واز آنریم کلنو بعنوان DNA polymerase استفاده میشد. این آنزیم در اثرحرارت دناتوره میشودو اجبارا"باید دوباره در هر سیکل به واکنش اضافه شود. Saiki از آنزیم DNA polymerase مقاوم به حرارت که از باکتری ترموس آکواتیکوس خالص میشود و اصطلاحا" Taq DNA polymerase گفته میشود استفاده کرد وامروزه واکنشPCR بصورت اتوماتیک انجام میگیرد.

پارامتر های موثر در PCR :
1- زمان و دمای Denaturation بستگی به تعداد G و C دارد
2- دمای Annealing پرایمرها که باید 3-4 درجه کمتر از دمای ذوب پرایمر ها باشد
3- زمانPrimer extension که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد
4- - تعداد سیکلها
5- Ramp ( زمانی که طول میکشد تا دمای مبدا دستگاه به دمای مقصد برسد ) هرچه این زمان کمتر باشد نتیچه کار بهتر است و واکنش زمان کمتری در دمای ناخواسته قرار میگیرد
6- غلظت dNTP ها و یون منیزیوم ( اینها مجموعه ای را تشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز میشوند و غلظت این دو ماده تابعی از یکدیگر میباشند )
7- غلظت Template DNA ( یک دهم تا یک میکروگرم میباشد ) چنانچه DNA هدف بصورت مالتی کپی در ژنوم باشد بهتر است.
8- اضافه کردن تشدید کننده های PCR
10- حذف مها رکننده های آنزیم از محیط
11- بهتر نقطه ذوب پرایمر ها (شبیه هم باشد ( Tm یکسان داشته باشند).
کاربردهای مهم PCR
تهیه نسخه‌های متعدد از یک ژن مورد نظر: گاهی برای مطالعات بیولوژی مولکولی لازم است که یک ژن با نسخه‌های نسبتا زیاد در دسترس باشد. بدین منظور می‌توان با استفاده از روش PCR ژن مورد نظر را در مقایسه با بقیه ژن‌ها تکثیر نمود.
بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن: با استفاده از این روش می‌توان تشخیص داد که آیا یک ژن در یک سلول حضور دارد یا نه؟ گاهی نیز از این مطالعات برای بررسی وجود ژنهای مختلف باکتری‌ها یا ویروس‌ها در بدن افراد استفاده می‌کنند.
تشخیص بیماری‌های قبل از تولد: با استفاده از PCR و بکار گرفتن پرایمرهای مربوط به یک ژن بیمار و پرایمرهای مربوط به ژن سالم آلل آن می‌توان از تولد کودکان دارای بیماری‌های ژنتیکی جلوگیری کرد. برای این کار بعد از لقاح تخمک در آزمایشگاه ، بعد از رسیدن تخمک به حالت 10 سلولی ، یک سلول را جدا کرده و با استفاده از پرایمرها از ژن مورد نظر PCR صورت می‌گیرد، اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تکثیر پیدا کرد، این مفهوم هموزیگوت بودن سلول‌های جنینی و سالم بودن آنهاست.
تعیین جنسیت جنین: معمولا چند تخمک با چند اسپرم در آزمایشگاه لقاح می‌یابند و سپس اجازه تکثیر به سلول تخم داده و با رسیدن تخم به مرحله ده سلولی ، یکی از سلول‌ها را جدا کرده و بوسیله پرایمرهای ویژه مربوط به کروموزوم y مورد PCR قرار می‌گیرد. کروموزوم y منحصرا در سلول‌های نر دیده می‌شود. اگر قطعه تولید نشده در PCR بوسیله الکتروفورز و بطور دقیق‌تر توسط ساترن بلوتینگ تشخیص داده شد، جنین از نوع پسر و در غیر این صورت دارای کروموزوم‌های xx خواهد بود
تشخیص بیماریها
کشت میکروبها که جهت تشخیص بیماریهای عفونی در اکثر آزمایشگاهها بکار می‌رود. زمان‌بر بوده و ثانیا باعث افزایش تعداد میکروب‌های بیماریزا و غیر بیماریزا در شرایط آزمایشگاهی می‌گردد. امروزه در برخی آزمایشگاهها روش PCR جایگزین روش‌های کشت شده است. یعنی قطعه‌ای از ژن مربوط به میکروب بیماریزا مورد شناسایی قرار گرفته و پرایمرهای مربوط تولید می‌شوند، با استفاده از این پرایمرها می‌توان تشخیص داد که آیا ویروس ایدز در داخل بدن وجود دارد یا نه؟
مشکل PCR و راه حل آن
اشکال PCR ، آلودگی نمونه‌های مورد بررسی توسط قطعات DNA خارجی است. اگر قبلا در داخل دستگاهی PCR یک نمونه انجام گرفته باشد. و ذره کوچکی از آن در داخل دستگاه باقی بماند. در PCR نمونه بعدی مشکل ایجاد خواهد کرد. برای رفع مشکل امروزه از ظروف یکبار مصرف استفاده می‌شود. کلیه ظروف قبل از استفاده اتوکلاو می‌شوند تا سلول‌ها و مولکولهای موجود در آنها ، حتی‌الامکان غیر فعال می‌شوند.

مالتيپل اسکلروز(1)

Msچيست ؟

مالتيپل اسکلروزيس يک بيماری التهابی سيستم عصبی مرکزی(مغز و طناب نخاعی) است. به طور برجسته يه بيماری مربوط به ماده سفيد است. ماده ی سفيد از از فيبرهای عصبی ساخته شده است که مسئول انتقال ارتباصات بين قسمت های داخلی خود سيستم عصبی مرکزی و سيستم عصبی مرکزی با اعصاب ساير نقاط بدن است.

در بيماران مبتلا،تکه های اسيب ديده و ضايعات در قسمت هايی از ماده ی سفيد سيستم عصبی مرکزی به وجود می آيند. در محل يک ضايعه،ماده ی عايع عصب(ميلين) از دست می رود . از نظر کلينيکی مالتيپل اسکلروزيس شرايط سختی برای توصيف کردن دارد زيرا اين بيماری غير قابل پيش بينی و متغير است. بسته به اينکه چه مناطقی از سيستم عصبی مرکزی الوده بشوند و به چه مقدار آسيب ببينند،نوع و شدت شکايات می توانند خيلی متفاوت باشند.
هيچ دو نفری نيستند که به اين بيماری دقيقاً از يک راه مبتلا شوند و هيچ دو نفری نيستند که حالات يکسانی از خود در اين بيماری نشان دهند. به هر حال مراحل مختلف بيماری بين هر فرد و کل جمعيت به طور عمده در زمان و محل ضايعه متفاوت هستند. ولی هم تحت يک پروسه يکسان که شامل از بين رفتن غلاف ميلين اعصاب است به اين بيماری دچار می شوند.
اگرچه تحقيقات اخير نشان داده است که تشکيل بيوشيميايی ضايعات، بين فرم های مختلف بيماری متفاوت است،ولی اين دليل تفاوت بين علائم افراد مختلف نيست، اين به دليل آن است که تخريب يک ناحيه می تواند علايم کاملاً متفاوت با تخريب ناحيه ديگر داشته باشد.
به طور کلی افراد مبتلا به اين بيماری می توانند از دست رفتن کامل يا جزيی عملکردهايی را که به وسيله مغز يا نخاع کنترل می شوند يا پيام هايشان از آن نواحی عبور می کند را تجربه کنند.

Ms انواع مختلف بيماری

بر طبق براورد نورولوژيست ها چهار نوع اصلی وجود دارد(تمام نمودارها درجه ناتوانی را در طول زمان نشان می دهند-جايی که دو خط در نمودار وجود دارد دو روند مختلف از يک فرم و شکل بيماری را مشخص می کند.)

-نوع تخريبی(عود کننده)/بهبودی1

اين نوع به وسيله يک روند بازگشتی شناخته می شود (همچنين ب عنوان تشديد نيز شناخته می شود.) در طول زمان نشانه های جديد می توانند ظاهر شوند يا اينکه عليائم قديمی دوباره شکل بگيرند يا تشديد شوند. به دنبال مرحله تخريب دوره هايی از بهبود وجود دارد،و اين بهبودی به صورت جزيی يا کلی بعد از دوره های تخريب به وجود می آيد. تخريب و پيشرفت بيماری ممکن است چند روز يا چند هفته يا چند ماه به طول بينجامد و دوره های بهبود هم میتواند آهسته،تدريجی يا به گاهی اوقات ناگهانی باشد.کسر زيادی از افرادی که به مالتيپل اسکلروز مبتلا هستند در ابتدا به اين نوع از بيماری مبتلا هستند. اين نوع معمولا ً در سن 30 تا 40 سالگی اتفاق می افتد و در زنان دو برابر مردان است.

2-پيشرونده ثانويه:

بعد از چند سال بسياری از افرادی که دچار حالت نوع يک هستند وارد مرحله پيشرونده ثانويه بيماری می شوند. که اين مرحله به وسيله بدتر شدن وضعيت بيماری در طول دوره های تخريب مشخص می شود.در فاز ابتدايی اين مرحله، بيمار هنوز ممکن است دوره هايی از بازگشت و عود کردن بيماری را تجربه کند اما بعد از مدتی اين مرحله به يک پيشرفت تدريجی و گام به گام تبديل می شود. افراد دچار اين نوع از مالتيپل اسکلروز میتوانند روزها و هفته های خوب و بدی را تجربه کنند اما صرف نظر از بهبود جزيی بعد از عود کردن بيماری بهبودی حقيقی وجود ندارد. بعد از 10 سال،50% از مبتلايان به نوع يک بيماری ام اس وارد فاز دوم اين بيماری می شوند. بعد از 25 تا 40 سال اين الگو به 90% افزايش می يابد.

3-مالتيپل اسکلروز عود شده پيشرفته:

اين فرم از بيماری به دنبال يک دوره پيشرونده از بيماری قرار دارد که در اين حالت دوره هايی از تشديد بيماری وجود دارد که بعد از آن يک بهبود سريع وجود دارد اما از يک دوره به دوره ی ديگر علائم به صورت تدريجی تشديد می شوند.

4- پيشرنده اوليه:

اين توع از بيماری ms به صورت دوره ای از پيشرفت تدريجی بيماری که در آن هيچ نوع بهبودی وجود ندارد شناخته می شود.
ممکن است دوره هايی از توقف پيشرفت بيماری وجود داشته باشد و مانند نوع پيشرونده ثانويه افراد میتوانند روزها و هفته های خوب و بدی را تجربه کنند.افراد مبتلا در طول مدت دوره های تخريبی و بهبودی با هم تفاوت دارند و معمولاً شروع فاز پيشرونده ثانويه در افراد بيمار در اواخر 30 سالگی يا اوايل 40 یالگی قرار دارند میباشد، در مردان و زنان نيز به يک تسبت ظاهر میشود و شروع فعاليت بيماری در ناحيه طناب نخاعی ميباشد ومغز را درگير نمی کند. با اينکه نوع پيشرونده ی اوليه در ابتدا به ناحيه مغز نيز آسيب می زند ولی اثرات کمتری نسبت به فازهای پيشرفته نوع1 و نوع 2 بر روی مغز باقی می گذارد برای همين افراد مبتلا به نوع پيشرونده ی اوليه کمتر دچار اختلالات شناختی می شوند.

( در هر 4 نمودار نشان داده شده روند پيشرفت بيماری می باشد که گاهی اوقات همراه با بهبودی بازگشت به حالت اول و گاهی اوقات با پيرفت بيشتر بيماری به سمت مراحل بالاتر و خطرناک تر همراه است.)

آيا اعصاب بعد از دست دادن غلاف ميلين خود بهبود می يابند؟

بعد از از دست رفتن غلاف ميلين اعصاب حالات مختلفی می تواند رخ دهد. در مرحله ی التهاب تدريجی اعصاب نورون هايی که تخريب نشده اند به کار خود ادامه می دهند و دست کم در مراحل بتدايی حالت تخريبی/بهبودی دوره هايی از بهبود را شاهد هستيم.
اکسون های بدون غلاف می توانند علکرد قابل توجهی از خود علارقم از دست غلاف ميلين خود نشان دهند. تحقيقات اخير نشان داده که آنها تعداد بيشتری کانال های سديمی توليد می کنند. اينها دروازه های ويژه ای هستند که به صورت اينتگرال پيام های اعصاب را ارسال میکنند. اين افزايش کانال های سديمی با بهبودی درMs در ارتباط است.
سيستم عصبی مرکزی يک ارگان بسيار شکل پذير است و راه های جديد عصبی و ارتباطات آن میتوانند در اطراف ناحيه ی آسيب ديده به وجود بيايند. مانند اينکه يک موتور سوار که برای گذر از ترافيکی که در مسير او قرار دارد از يک مسير باريک برای عبور استفاده می کند. اگرچه مشخص است که اين مکانيسم در ارتباط با بهبودی می باشد ولی هنوز مطالب زيادی در اين حوزه وجود دارد.
ميلين سلول های نگهدارنده در سيستم عصبی مرکری می باشد،اليگودندرسيتها،میتوانند حامی و ضامن عمل ترميم ميلين باشند-فرايندی است که به موجب آن غلاف ميلين اصراف اکسون ها ترميم می شود. علارفم اين امر که تست ها به طور بالقوه ای نشان دهنده ی آن هستند که آکسون های ترميم شده به خوبی آن دسته از اکسون هايی که هرگز دچار تخريب نشده اند عمل نمی کنند البته برای افراد مبتلا به مالتيپل اسکلروز گاهی اين موضوع غير قابل لمس است.اگرچه ترميم غلاف معمولاً ميلين فقط در حاشيه ضايعات ايجاد می شود ولی باز هم به عنوان يک فاکتور کمک کننده در بهبود مطرح است.
ترميم ميلين ممکن است برای مدت اندکی بيشتر طورت نگيرد،حداقل برای يک زمان طولانی صورت نمی گيرد، که ناشی از کمبود اليگودندرسيت ها است. زمانی که اين اتفاق می افتد نرون ها شروع به عملکرد به شکل غير طبيعی می کنند،اما اکسون بدون اسيب باقی می مانند.گاهی اوقات بعد از گذشت يک زمان طولانی و گاهی برای سال ها يک اکسون میتواند خود به خود غلاف ميلينش ترميم شود و دوباره بيشتر عملکردی را که فرض می شد که به طور هميشگی از دست داده است بازيابد.
ميلين از دست رفته می تواند به وسيله ی يک بافت اسکار( شبيه به بافتی است که در هنگام برش خوردن و زخمی شدن پوست محل بين دو برش را پر می کند) پوشيده شود. در واقع نام اين بيماری هم از همين جا گرفته شده است به طوری که مالتيپل به معنی زياد و اسکلروز به معنی شکل اسکار می باشد.
بافت اسکار می تواند مانع از تشکيل غلاف ميلين جديد شود و اکسونی که دچار اين عارضه شود ديگر نمی تواند عملکرد پيشين خود را باز يابد.
چنين اکسونی میتواند رفته رفته پژمرده شود و عملکرد خود را به طور کامل از دست بدهد و مشخصاً اين اکسون هرگز دوباره شروع بع فعاليت نمی کند. از نظر الکتريکی شبيه اين می باشد که يک کابل را به وسيله ی سيم چين قطع کنيم.

يه ضرب المثل جالبی برای اين بيماری هست که ميگه:

"Hope for the best, but prepare for the worst".
به بهترين ها اميد داشته باش،ولی خودت رو برای بدترين ها آماده کن.


علل ايجاد بيماری Ms:

1- خود ايمنی
2- وجود عوامل بيماری زا
3- عوامل ژنتيکی
4- آسيب به سد خونی مغزی
5- اختلالات بيوشيميايی در چرخه اوره
6- رژيم و کمبود ويتامين
7- واکنش های آلرژيک و عوامل ديگر

خواستن

جداً اينکه ميگن بعضی ها فعل خواستن رو صرف واقعاً درسته و اون کسايی که ميخوان به جايی برسن و وقتی بخوان حتماً به هدفشون ميرسن و خدا هم به اونها کمک ميکنه و ميتونن هر سختی رو پشت سر بگذارن و اينکه که خيلی ميگن نمي شه به نظرم اشتباه،البته من هم يکی از همونايی هستم که ميگم نميشه و ميدونم که اشتباه ميکنم ولی نميدونم چرا هيج وقت تلاش نميکنم خودم رو درست کنم بلکه يه جوری سعی ميکنم به خودم بقبواونم که واقعاً نميشه نه اينکه من نمی خوام و همين هم هست که همه نمي تونن تو زندگی موفق بشن و فقط همون عده ای که واقعاً خواستن و عمل هم کردن ميتونم به هدفشون برسن و ميتونن کاری کنن که از خودشون و زندگی شون راضی باشن.و از اين نمونه ها کم هم نيستن پس ميشه نتيجه گرفت که خوب شدن غير ممکن نيست.

ديابت

ديابت يا مرض قند، بيماری مزمنی است که در آن نظم شوخت و ساز بدن مختل می شود. به همين غلظت قند خون افزايش ميابد که مربوط به کمبود يا عدم فعاليت هورمون انسولين مترشحه از پانکراس می باشد. در واقع در پانکراس چهار دسته سلول وجود دارد که دسته سلول های نوع بتا در آن مسئول ترشح انسولين هستند و وظيفه انسولين آزاد سازی گلوکز از کبد می باشد که عکس اين عمل توسط سلول های آلفا پانکراس که مسئول ترشح گلوکاگون هستند انجام ميگيرد و موجب ذخيره گلوکز در کبد به صورت گلوکاگون مي شوند. گاهی اوقات به دلايل مختلف ممکن است سلول های بتا دچار کمبود ترشح شوند البته گاهی هم ممکن است سلول های بتا درست عمل کنند و انسولين را به ميزان کافی ترشح کنند ولی به علت اختلال در سلول های بدن که ممکن است فاقد گيرنده های انسولين باشند و يا گاهی اوقات به علت وجود يک سری مواد خنثی کننده ی انسولين فرد دجار بيماری ديابت شود.

نشانه های بيماری ديابت

بيماری ديابت در مراحل اوليه علائم بارزی ندارد ولی به تدريج که پيشرفت نمود،ممکن است يک يا چند نوع از علائم زير ظاهر شود:
تکرر ادرار،تشنگی زياد،کاهش وزن بدن،گرسنگی،ضعف بينايی،خارش و بی حسی دست و پا و خشکی زياد پوست، تاخير در ترميم زخم و عفونت های مکرر.

نسبت شيوع ديابت چقدر است

طبق آمار ارائه شده توسط سازمان جهانی بهداشت 150 ميليون نفر در جهان گرفتار ديابت هستند. در ايران حدود سه ميليون بيمار ديابتی شناسائی شده است و چون بخش اعظم مبتلايان خبر از بيماری خود ندارند نمی توان آمار دقيقی ارائه نمود. در عين حال به نظر می رسد که حد اقل 5 تا 6 درصد جمعيت به نحوی از ديابت و عوارض آن رنج ميبرند . اين نسبت در بعضی از نقاط کشور به علت تغذيه و روش زندگی نامناسب تا 10 درصد نيز گزارش شده است

تشخيص ديابت چگونه صورت ميگيرد

بيماری ديابت با افزايش قندخون مشخص مي شود.در اين حالت بيمار احساس تشنگی کرده و تکرر ادرار پيدا ميکند که به علت اين است که وقتی قند از طريق ادرار دفع ميشود آب را نيز با خود دفع مي کند زيرا کليه ها دارای يک حد اکثر ظرفيت برای انتقال گلوکز هستند زمانی گلوکز در پلاسمای فرد به بيش از دو برابر رسيد چون کليه ها توان جذب دوباره گلوکز را ندارند گلوکز در ادرار در موارد شديد ظاهر شده که با تست ادرار نيزمشخص ميشود.پزشک با مشاهده اين علامت ها مشکوک به ديابت شده و درخواست آزمايش مي کند که می تواند دو نوع تست استفاده شود:
1-FBS:در اين تست قند خون ناشتا را محاسبه ميکنند که بايد بين 70 تا 110 ميلی گرم در 100 ميلی ليتر خون باشد و افرادی با قند خون بين 110 تا 125 ميلی گرم در 100 ميلی ليتر خون غير طبيعی و بايد تحت مراقبت قرار گيرند و اگر فرد دارای قند بالای 125 باشد ديابتی محسوب ميشود ( در ازمايش ها منظور از قند در ميلی گرم ميزان گلوکز در ميلی گرم خون است.)

2- 2hpp: در اين تست قند خون فرد را 2 ساعت بعد از وعده ی غذايی (يا مصرف مواد قندی) محاسبه کرده که بايد زير 200 باشد.